本发明涉及一种电化学免疫传感器，更具体而言，本发明涉及一种基于Au杂化的介孔碳CMK-3（AuCMK-3）分别与中性红和硫堇两种电子媒介体作为二抗标记物构建的夹心型电化学免疫传感器、其制备方法以及由该方法制备的电化学免疫传感器在同时检测宫颈癌肿瘤标志物中的应用。本发明的电化学免疫传感器可以实现两个样品的同时检测，弥补单一指标的局限性，对进一步提高宫颈癌的早期确诊率具有重要的意义，同时可以推广至其他癌症肿瘤标志物的同时检测。
1.一种夹心型电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰rGO-TEPA孵化的一抗、牛血清蛋白、宫颈癌肿瘤标志物抗原和AuCMK-3分别与中性红、硫堇孵化的二抗，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极；xa0xa0xa0xa0其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：xa0xa0xa0xa0a、制备AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液；xa0xa0xa0xa0b、制备电化学免疫传感器工作电极；xa0xa0xa0xa0c、制作电化学免疫传感器工作曲线；xa0xa0xa0xa0其中，步骤a制备AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的具体步骤如下：xa0xa0xa0xa0①xa0AuCMK-3的合成：含有0.01g氯金酸的100xa0mL溶液放入烧瓶中加热至沸腾，再逐滴加入1%的柠檬酸钠并保持此温度40xa0min，冷却至室温，向该溶液中加入介孔碳CMK-3搅拌4h，最后在9000xa0转速下离心20xa0min，离心三次，真空干燥制得到Auxa0CMK-3；xa0xa0xa0xa0②xa0AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的制备：平行称取两份上述步骤①制备的Auxa0CMK-3，加入pH为7.4xa0的PBS超声使其溶解后，xa0分别加入anti-CEA，anti-SCCA的EDC-NHS溶液，在4℃下孵化12xa0h，然后再分别对应加入2xa0mg/mL中性红溶液、2xa0mg/mL硫堇溶液，并在4℃下孵化10xa0h，最后在6000xa0转速下离心20xa0min，洗涤后重新分散于pH为7.4的PBS中得到不同的二抗溶液；xa0xa0xa0xa0③xa0将步骤②制备的两份二抗溶液等体积混合得到AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液；xa0xa0xa0xa0步骤b制备电化学免疫传感器工作电极的具体步骤如下：xa0xa0xa0xa0①xa0将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；xa0xa0xa0xa0②xa0EDC和NHS，其浓度为50xa0mmol/L，加入到10xa0μg/mLxa0SCCA或10xa0μg/mLxa0CEA的一抗溶液中，然后再分别加入2xa0mg氨基化石墨烯，振荡4xa0h后离心，洗涤，用PBS稀释到原来的刻度，得到相应的rGO-TPEAxa0-Ab₁溶液，最后将两份溶液进行等体积混合得到的一抗混合溶液滴到电极上，室温晾干；xa0xa0xa0xa0xa0③xa0再在电极表面修饰质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液(BSA)xa0以消除电极的非特异性活性位点，用pH为7.4的PBS对电极进行清洗，晾干后，依次滴上不同浓度的宫颈癌两种肿瘤标志物抗原溶液，将抗原和抗体在室温孵化30xa0min，保证一抗和抗原形成半免疫复合物；xa0xa0xa0xa0④xa0将制备好的AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液修饰到电极上，在4xa0℃保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极；xa0xa0xa0xa0步骤c制作电化学免疫传感器工作曲线的具体步骤如下：xa0xa0xa0xa0①xa0将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；xa0xa0xa0xa0②xa0xa0pHxa07.4的PBS缓冲溶液作为底液，所述缓冲溶液含有0.1xa0mol/Lxa0KCl作为支持电解质，通过差分脉冲伏安法（DPV）检测修饰好的工作电极对中性红和硫堇在不同电位下的响应，所述中性红和硫堇对应的电位分别为-0.62V和-0.17V；根据不同电子媒介体所得电流响应与其对应的不同肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
2.如权利要求1所述的夹心型电化学免疫传感器在同时检测宫颈癌肿瘤标志物中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中，所述宫颈癌肿瘤标志物为SCCA和CEA。技术领域
本发明涉及一种电化学免疫传感器，更具体而言，本发明涉及一种基于Au杂化的介孔碳CMK-3（AuCMK-3）分别与中性红和硫堇两种电子媒介体作为二抗标记物构建的夹心型电化学免疫传感器、其制备方法以及由该方法制备的电化学免疫传感器在同时检测宫颈癌标志物中的应用。
背景技术
宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，虽然近几十年宫颈癌发病率明显下降，但每年我国宫颈癌新发病例仍达13.15万，约占世界宫颈癌新发病例的28.8%，且呈现年青化趋势。尽早、准确的发现宫颈癌前病变或宫颈癌是降低宫颈癌的发病率及死亡率的关键。而肿瘤标志物的发现及应用成为继影像诊断和病理诊断之后，当前临床检测肿瘤常用的方法之一，并用于肿瘤的随访及治疗效果观察。基于抗原-抗体之间特异性识别作用的免疫测定方法是检测肿瘤标志物的一种重要的分析技术。其中,xa0免疫传感器结合了高灵敏的传感技术和高特异的免疫反应，具有实时输出、分析灵敏度高、特异性强、使用简便且成本低的优点,xa0因此，免疫传感器被广泛应用于早期诊断及肿瘤标志物的检测。鉴于现有肿瘤标志物的敏感性和特异性不够理想，为了提高肿瘤标志物的临床应用价值，根据不同肿瘤和不同标志物的特性，合理选择多种标志物进行同时检测就显得十分重要。由于针对单个肿瘤标志物检测的分析效率不高，为了缩短分析时间、减少分析步骤、提高分析效率、降低测试成本等，人们开始关注于实现多个样品同时检测的高通量电化学免疫传感器的研究。宫颈癌的肿瘤标志物有很多，其中最主要的两种是癌胚抗原（CEA）和鳞状细胞癌相关抗原（SCCA）。对CEA及SCCA两种肿瘤标志物同时检测可弥补单一指标的局限性，对进一步提高宫颈癌的早期确诊率具有重要的意义。CN102980925A公开了一种基于哑铃型Pt-Fe₃O₄纳米粒子作为二抗标记物构建的夹心型电化学免疫传感器的制备方法及应用，该发明只实现了单一肿瘤标志物的检测。本发明利用rGO-TEPA的氨基和抗体自身的羧基发生酰胺反应，将rGO-TEPA用于固定一抗，AuCMK-3分别与中性红、硫堇两种不同电子媒介体作为二抗标记物，制备了同时检测CEA和SCCA两种肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器。测试结果显示，上述方法制备的电化学免疫传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时检测宫颈癌两种标志物的夹心型电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰rGO-TEPA孵化的一抗、牛血清蛋白、宫颈癌肿瘤标志物抗原和AuCMK-3分别与中性红、硫堇孵化的二抗。本发明的再一个目的在于提供一种同时检测宫颈癌两种标志物夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。所述宫颈癌两种标志物为CEA和SCCA。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的夹心型电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰rGO-TEPA孵化的一抗、牛血清蛋白、宫颈癌肿瘤标志物抗原和AuCMK-3分别与中性红、硫堇孵化的二抗。所述工作电极与参比电极、对电极组成夹心型电化学免疫传感器来检测宫颈癌的两种肿瘤标志物抗原。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。本发明的夹心型电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤：a、制备AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液；b、制备电化学免疫传感器工作电极；c、制作电化学免疫传感器工作曲线。其中，步骤a的制备Auxa0CMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的方法，具体包括以下步骤：①AuCMK-3的合成：含有0.01g氯金酸的100xa0mL溶液放入烧瓶中加热至沸腾，再逐滴加入1%的柠檬酸钠并保持此温度40xa0min，冷却至室温。向该溶液中加入介孔碳CMK-3搅拌4h。最后在9000xa0转速下离心20xa0min，离心三次，真空干燥制得到AuCMK-3；②AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的制备：平行称取两份上述步骤①制备的Auxa0CMK-3，加入pH为7.4xa0的PBS超声使其溶解后，xa0分别加入anti-CEA，anti-SCCA的EDC-NHS溶液，在4℃下孵化12xa0h。然后，再分别对应加入2xa0mg/mL中性红溶液，2xa0mg/mL硫堇溶液，并在4℃下孵化10xa0h，最后在6000xa0转速下离心20xa0min，洗涤后重新分散于pH为7.4的PBS中得到不同的二抗溶液；③xa0将步骤②制备的两份二抗溶液等体积混合得到AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液。步骤b的制备电化学免疫传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤：①xa0将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；②xa0EDC和NHSxa0(50xa0mmol/L)xa0加入到10xa0μg/mLxa0SCCA或10xa0μg/mLxa0CEA的一抗溶液中，然后再分别加入2xa0mg氨基化石墨烯，振荡4xa0h后离心，洗涤，用PBS稀释到原来的刻度，得到相应的rGO-TPEAxa0-Ab₁溶液，最后将两份溶液进行等体积混合得到的一抗混合溶液滴到电极上，室温晾干；③xa0再在电极表面修饰质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液(BSA)xa0以消除电极的非特异性活性位点。用pH为7.4的PBS对电极进行清洗，晾干后，依次滴上不同浓度的宫颈癌两种肿瘤标志物抗原溶液，将抗原和抗体在室温孵化30xa0min，保证一抗和抗原形成半免疫复合物；④xa0将制备好的AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液修饰到电极上，在4xa0℃保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。步骤c的制作电化学免疫传感器工作曲线，步骤如下：①xa0将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；②xa0xa0pHxa07.4的PBS缓冲溶液(含0.1xa0mol/LKCl作为支持电解质)作为底液，通过差分脉冲伏安法（DPV）检测修饰好的工作电极对中性红（-0.62V）和硫堇（-0.17V）在不同电位下的响应；根据不同电子媒介体所得电流响应与其对应的不同肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。本发明的有益成果：（1）本发明的发明人将rGO-TEPA引入到肿瘤标志物的电化学免疫传感器的制备当中，由于rGO-TEPA具有较大的比表面积和更多的氨基，所以可以通过酰胺作用固载更多的一抗，从而提高了传感器的灵敏度。（2）在本发明的制备方法中，AuCMK-3复合材料同时具有Au和介孔碳材料的优势，用于固载大量的电子媒介体作为标记二抗，因此进一步提高了传感器的灵敏度，从而实现对超低浓度的免疫分子高灵敏的放大检测。（3）利用电子媒介体标记二抗，通过不同电子媒介体具有不同的氧化还原电位，可实现宫颈癌两种肿瘤标志物的同时检测。本发明的电化学免疫传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析。
附图说明
下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。图1为本发明的AuCMK-3的SEM照片。图2为本发明的免疫传感器对CEAxa0(A)和SCCAxa0(B)测定的工作曲线。
具体实施方式
本发明使用的CEA、SCCA均购自上海领潮生物科技有限公司，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)、xa0N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自上海晶纯试剂有限公司，中性红、硫堇购自国药集团化学试剂有限公司，xa0rGO-TPEA购于南京先丰纳米材料科技有限公司，柠檬酸钠购自上海精化科技研究所，牛血清白蛋白(96%-99%)购自Sigma-Aldrich公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。实施例1xa0制备夹心型电化学免疫传感器（1）制备AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液AuCMK-3的合成：含有0.01g氯金酸的100xa0mL溶液放入烧瓶中加热至沸腾，再逐滴加入10xa0mLxa01%的柠檬酸钠并保持此温度40xa0min，冷却至室温。向该溶液中加入介孔碳CMK-3搅拌4h。最后在9000xa0转速下离心20xa0min，离心三次，真空干燥制得到AuCMK-3；图1为AuCMK-3的SEM照片，由该图可知，Au纳米粒子均匀分散于介孔碳CMK-3的表面；AuCMK-3和电子媒介体孵化的二抗(Ab₂)溶液的制备：平行称取两份上述步骤①制备的Auxa0CMK-3xa0(4xa0mg)，加入pH为7.4xa0的PBS超声使其溶解后，分别加入anti-CEA，anti-SCCA的EDC-NHS溶液，在4℃下孵化12xa0h。然后，再分别对应加入2xa0mg/mL中性红溶液，2xa0mg/mL硫堇溶液，并在4℃下孵化10xa0h，最后在6000xa0转速下离心20xa0min，洗涤后重新分散于pH为7.4的PBS中得到不同的二抗溶液；将上述二抗溶液等体积混合得到AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液。（2）制备电化学免疫传感器工作电极①xa0将直径为4xa0mm的玻碳电极用1.0、0.3、0.05xa0μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0.05xa0mol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~xa00.6xa0V扫描，使峰电位差小于110xa0mV，用超纯水清洗电极表面，吹干；②xa0EDC和NHSxa0(50xa0mmol/L)xa0加入到10xa0μg/mLxa0SCCA或10xa0μg/mLxa0CEA的一抗溶液中，然后再分别加入2xa0mg氨基化石墨烯，振荡4xa0h后离心，洗涤，用PBS稀释到原来的刻度，得到相应的rGO-TPEAxa0-Ab₁溶液，最后将两份溶液进行等体积混合得到的一抗混合溶液取6xa0μL滴到电极上，室温晾干；③xa0再在电极表面修饰6xa0μL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液(BSA)xa0以消除电极的非特异性活性位点。用pH为7.4的PBS溶液对电极进行清洗，晾干后，依次滴上6xa0μLxa0不同浓度的SCCA抗原溶液和6xa0μL不同浓度的CEA抗原溶液，将抗原和抗体在室温孵化30xa0min，保证一抗和抗原形成半免疫复合物；④xa0将6xa0μLxa0AuCMK-3-anti-CEA-中性红和AuCMK-3-anti-SCCA-硫堇的二抗混合溶液修饰到电极上，在4xa0℃保存晾干，即得到电化学免疫传感器的工作电极。（3）制作电化学免疫传感器工作曲线打开电化学工作站，xa0将参比电极—饱和甘汞电极、对电极—铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；10xa0mLxa0pHxa07.4的PBS缓冲溶液(含0.1xa0mol/LKCl作为支持电解质)作为底液，通过差分脉冲伏安法（DPV）检测修饰好的工作电极对中性红（-0.62V）和硫堇（-0.17V）在不同电位下的响应；根据不同电子媒介体所得电流响应与其对应的不同肿瘤标志物抗原标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。实施例2xa0宫颈癌肿瘤标志物的同时检测：SCCA和CEA按照实施例1所述的步骤制备电化学免疫传感器，采用该电化学免疫传感器同时检测表1所示的宫颈癌肿瘤标志物，其检测技术指标见表1。表1xa0xa0宫颈癌肿瘤标志物的检测技术指标xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="492"/>由表1检测技术指标结果可知，本发明制备的电化学免疫传感器用于宫颈癌肿瘤标志物的同时检测，其线性范围宽，检测限低，方法灵敏度高。实施例3xa0xa0人血清中宫颈癌肿瘤标志物的同时检测配制CEA抗原的浓度依次为0.05，1.0，5.0，10，15，20xa0ng/mL和SCCA抗原的浓度依次为0.03，1.0，5.0，10，15，20xa0ng/mL，根据实施例1绘制得到相应工作曲线，分别如图2A和图2B所示，用于人血清中CEA和SCCA的同时检测。取新鲜血清样品，离心分离后取上清液，用PBS缓冲溶液稀释后测定出人血清中CEA和SCCA的含量。然后向人血清中加入一定浓度的CEA和SCCA标准溶液，进行加标回收实验，通过测定得到的回收值与加入量的比值计算出样品中CEA和SCCA的平均回收率，检测结果见表2。表2xa0xa0人血清中宫颈癌肿瘤标志物的检测结果xa0ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="516"/>上表中n为平行测定的次数。由表2检测结果可知，结果的相对标准偏差（RSD）小于5.0%，平均回收率为96.0~xa0104%，表明本发明用于人血清中宫颈癌肿瘤标志物的同时检测，方法的精密度高，结果准确可靠。